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葡聚糖凝膠柱
更新時(shí)間:2011-03-09 | 點(diǎn)擊率:1871
(1) 預(yù)處理
稱(chēng)取
葡聚糖凝膠
(有不同型號(hào))若干克,加入洗脫劑(通常為甲醇或者水,這里以甲醇為例)約20倍凝膠量,置室溫下3h進(jìn)行溶脹,溶脹必須*,否則會(huì)使上柱后流速變慢,凝膠斷裂等。
(2) 裝柱
凝膠層析柱的直徑與柱長(zhǎng)之比一般為1:15。柱的底部用裝有細(xì)玻璃管的橡皮塞塞緊,用洗凈的玻璃絲(約200目尼龍布)墊底或購(gòu)買(mǎi)類(lèi)似規(guī)格的商品柱。然后將柱垂直安裝好,接著將溶脹好的凝膠邊攪勻邊緩緩連續(xù)裝入,色譜柱的出口流速m維持在5~10ml/min。凝膠顆粒沉積到柱底后關(guān)緊色譜柱,等沉降到1-2cm時(shí)再2打開(kāi)色譜柱。直至降到滿(mǎn)意高度為止,等凝膠柱內(nèi)的液體留的與凝膠高度差不多時(shí),用較小的濾紙蓋住凝膠床表面,再用洗脫劑洗脫過(guò)夜。裝柱后的凝膠必須均勻,不能有氣泡或明顯條紋。否則,必須到出重裝。
(3) 加樣
裝好的色譜柱至少要用相當(dāng)于3倍保留體積的洗脫劑平衡,待洗脫劑流至與凝膠柱液面相平時(shí)(不能流干,否則會(huì)帶入氣泡),用滴管吸取樣品溶液,在高于凝膠表面約1cm處,沿管壁四周緩緩滴加樣品液,加完后打開(kāi)下面的出口,使樣品滲入凝膠內(nèi)。再關(guān)閉出口,用少量洗脫液將管壁殘留的樣品洗下,再打開(kāi)出口,至溶液滲入柱內(nèi),再關(guān)閉出口。可以考慮再加一層薄薄的脫脂棉以保護(hù)柱表面(我一般不加),然后即可進(jìn)行洗脫。
(4) 洗脫與收集
洗脫時(shí),用甲醇作洗脫劑,并且要連續(xù)不斷地進(jìn)行,使凝膠柱上端保持一定的液層,防止凝膠柱表面的液體流干。一般酸性洗脫劑中堿性物質(zhì)容易洗脫,堿性洗脫劑中酸性物質(zhì)容易洗脫。多糖類(lèi)物質(zhì)等極性大的物質(zhì)考慮用水洗脫,常用的洗脫劑是水-甲醇,水-乙醇,水-丙酮等,一般根據(jù)自己樣品的性質(zhì)選擇洗脫液,洗脫液可一直用單一梯度。凝膠色譜的共性是流速慢,每份一般體積較小。(內(nèi)徑1.3cm左右,長(zhǎng)80cm左右的柱子我一般每份收集液為8ml)
(5) 凝膠的再生和回收
凝膠柱多次使用后,若污染嚴(yán)重,則考慮用50度左右的2%的NaOH和0.5mol/LNaCl混合液浸泡后,再用水洗凈即可。
通常層析柱經(jīng)洗脫劑再生、平衡后,就可反復(fù)使用。但使用過(guò)多次后凝膠床體積變小,流速降低,凝膠污染雜質(zhì)過(guò)多,甚至變色,需經(jīng)再生后才可使用。再生方法有多種:如(
1
)用水進(jìn)行逆向沖洗,再用洗脫劑平衡,便可重新使用。又如(
2
)把凝膠倒出,用
6mol/L
脲浸泡凝膠半小時(shí),抽濾,再用水漂洗數(shù)次,除凈脲,必要時(shí)重復(fù)上述操作即可重新使用。
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