培養(yǎng)基的制備和滅菌

一、目的要求

1、了解并掌握培養(yǎng)基的配制、分裝方法

2、掌握各種實(shí)驗(yàn)室滅菌方法及技術(shù)

二、基本原理

培養(yǎng)基是供微生物生長、繁殖、代謝的混合養(yǎng)料。由于微生物具有不同的營養(yǎng)類型，對營養(yǎng)物質(zhì)的要求也各不相同，加之實(shí)驗(yàn)和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類很多，使用的原料也各有差異，但從營養(yǎng)角度分析，培養(yǎng)基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長素以及水分等。另外，培養(yǎng)基還應(yīng)具有適宜的pH值、一定的緩沖能力、一定的氧化還原電位及合適的滲透壓。
瓊脂是從石花菜等海藻中提取的膠體物質(zhì)，是應(yīng)用zui廣的凝固劑。加瓊脂制成的培養(yǎng)基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。但多次反復(fù)融化，其凝固性降低。
任何一種培養(yǎng)基一經(jīng)制成就應(yīng)及時(shí)*滅菌，以備純培養(yǎng)用。一般培養(yǎng)基的滅菌采用高壓蒸汽滅菌。

三、器材

1、溶液或試劑  蛋白胨、NaCl、K2HPO4、瓊脂、NaNO3、KCl、MgSO4、FeSO4等等見培養(yǎng)基配方。

2、儀器或其他用具  電子天平、高壓蒸汽滅菌鍋、稱量紙、牛角匙、精密pH試紙、量筒、刻度搪瓷杯、試管、三角瓶、漏斗、分裝架、移液管及移液管筒、培養(yǎng)皿、玻璃棒、燒杯、試管架、酒精燈、電爐等。

四、操作步驟

基本流程：稱藥品→溶解→調(diào)pH值→融化瓊脂→過濾分裝→包扎標(biāo)記→滅菌→擺斜面或倒平板。

1、 稱量藥品

根據(jù)培養(yǎng)基配方及配制量依次準(zhǔn)確稱取各種藥品，放入適當(dāng)大小的燒杯中，瓊脂不要加入。蛋白胨極易吸潮，故稱量時(shí)要迅速。

2、溶解
用量筒取一定量（約占總量的2/3）蒸餾水倒入燒杯中，在電爐上小火加熱，并用玻棒攪拌，以防液體溢出。待各種藥品*溶解后，停止加熱，補(bǔ)足水分。如果配方中有淀粉，則先將淀粉用少量冷水調(diào)成糊狀，并在火上加熱攪拌，然后加足水分及其它原料，待*溶化后，補(bǔ)足水分。

3、調(diào)節(jié)pH
根據(jù)培養(yǎng)基對pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液調(diào)至所需pH。測定pH可用pH試紙或酸度計(jì)等。

4、溶化瓊脂
      固體或半固體培養(yǎng)基須加入一定量瓊脂。瓊脂加入后，置電爐上一面攪拌一面加熱，直至瓊脂*融化后才能停止攪拌，并補(bǔ)足水分（水需預(yù)熱）。注意控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。

5、分裝
分裝時(shí)注意不要使培養(yǎng)基沾染在管口或瓶口，以免引起污染。液體分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。固體分裝裝量為管高的1/5，半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜；分裝三角瓶，其裝量以不超過三角瓶容積的2/3為宜。

6、包扎標(biāo)記
培養(yǎng)基分裝后加好硅膠塞或試管帽。在在瓶壁或管壁上標(biāo)明培養(yǎng)基名稱，制備組別和姓名、日期等。

7、滅菌

培養(yǎng)基應(yīng)按培養(yǎng)基配方中規(guī)定的條件及時(shí)進(jìn)行滅菌。普通培養(yǎng)基為121℃ 20min，以保證滅菌效果和不損傷培養(yǎng)基的有效成份。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，如需要作斜面固體培養(yǎng)基，則滅菌后立即擺放成斜面，斜面長度一般以不超過試管長度的1/2為宜。

7.1高壓蒸汽滅菌法
高壓蒸汽滅菌用途廣，效率高，是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中zui常用的滅菌方法。這種滅菌方法是基于水的沸點(diǎn)隨著蒸汽壓力的升高而升高的原理設(shè)計(jì)的。當(dāng)蒸汽壓力達(dá)到1.05kg/cm2時(shí)，水蒸氣的溫度升高到121℃，經(jīng)15～30min，可全部殺死鍋內(nèi)物品上的各種微生物和它們的孢子或芽孢。一般培養(yǎng)基、玻璃器皿以及傳染性標(biāo)本和工作服等都可應(yīng)用此法滅菌

7.2操作方法和注意事項(xiàng)如下 :
7.2.1  加水
打開滅菌鍋蓋，向鍋內(nèi)加水到水位線。立式消毒鍋用已煮開過的水，以便減少水垢在鍋內(nèi)的積存。注意水要加夠，防止滅菌過程中干鍋。
7.2.2  裝料、加蓋
滅菌材料放好后，關(guān)閉滅菌器蓋，使蒸汽鍋密閉，勿使漏氣。
7.2.3  排氣                                     

打開排氣口（也叫放氣閥）。分別設(shè)定所需滅菌溫度和時(shí)間（鍋體上的定時(shí)器為一壓控開關(guān)）。接通電源加熱，待水煮沸后，水蒸氣和空氣一起從排氣孔排出，當(dāng)有大量蒸汽排出時(shí)，維持5min，使鍋內(nèi)冷空氣*排凈。
7.2.4  升壓、保壓和降壓
當(dāng)鍋內(nèi)冷空氣排凈時(shí)，即可關(guān)閉排氣閥，壓力開始上升。當(dāng)壓力上升至所需壓力時(shí)，滅菌鍋?zhàn)詣?dòng)控制加熱開關(guān)以維持恒溫，待設(shè)定時(shí)間到達(dá)（一般培養(yǎng)基和器皿滅菌控制在121℃，20min）后，自動(dòng)停止加熱，待壓力降至接近“0”時(shí)，打開放氣閥。注意不能過早過急地排氣，否則會(huì)由于瓶內(nèi)壓力下降的速度比鍋內(nèi)慢而造成瓶內(nèi)液體沖出容器之外。

8、無菌檢查

將已滅菌培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24~48小時(shí)，以檢查滅菌是否*。

本實(shí)驗(yàn)分離用培養(yǎng)基的配方:

A．1/5NB培養(yǎng)基（各成分取1/5）

    營養(yǎng)肉湯（nutrient broth）培養(yǎng)基（1L）：

牛肉膏（beef extract）             3g /l；

蛋白胨 （soy peptone）              5g /l；

pH 7.0

B．喹啉降解菌分離用培養(yǎng)基     單位    g/L

Na2HPO4                             1.6

KH2PO4                              1.0

NH4Cl                               0.5

K2SO4                                  0.06

CaCl2·2 H2O                         0.025

MgCl2·6 H2O                         0.1

NaHCO3                                 0.42

EDTA·Na2                            0.015

FeSO4·7H2O                          0.0015

D-BIOTIN                             0.010

KNO3                                     0.505

配制時(shí)每一成分逐一溶化，否則會(huì)產(chǎn)生沉淀。

以喹啉作為*碳源時(shí)，喹啉的加入量為0.5～2 mmol/L（或40ul/L～150ul/L）。對于固體培養(yǎng)基，喹啉的加入量為每塊平板2ul～10ul喹啉（置于培養(yǎng)基表面）。

*喹啉要在培養(yǎng)基滅菌后加入

制備固體分離培養(yǎng)基時(shí)需加入1.5g agar/100ml培養(yǎng)基。

C．反硝化富集培養(yǎng)基   單位  g/L

Na2HPO4                              1.6

KH2PO4                               1.0

NH4Cl                                0.5

K2SO4                                   0.06

CaCl2·2 H2O                          0.025

MgCl2·6 H2O                          0.1

NaHCO3                                     0.42

EDTA·Na2                             0.015

FeSO4·7H2O                           0.0015

D-BIOTIN                              0.010

KNO3                                        0.505

乙酸鈉                                 1

酒石酸鈉鉀                             2

   * 喹啉（苯酚）                           40ul（300mg） 

配制時(shí)每一成分逐一溶化，否則會(huì)產(chǎn)生沉淀。 

*喹啉（苯酚）要在培養(yǎng)基滅菌后加入

制備固體分離培養(yǎng)基時(shí)需加入1.5g agar/100ml培養(yǎng)基。

D. 1/10TSA（Tryptic soy agar）培養(yǎng)基（各成分取/10）：

胰蛋白胨                   15 g/l,

大豆胨 （Soytone）          5 g/l,

NaCl                       5 g/l,

瓊脂                       15 g/l

E．苯酚降解菌分離用培養(yǎng)基     單位    g/L

Na2HPO4                               1.6

KH2PO4                               1.0

NH4Cl                                0.5

K2SO4                                   0.06

CaCl2·2 H2O                         0.025

MgCl2·6 H2O                         0.1

NaHCO3                                 0.42

EDTA·Na2                            0.015

FeSO4·7H2O                          0.0015

D-BIOTIN                             0.010

KNO3                                     0.505

配制時(shí)每一成分逐一溶化，否則會(huì)產(chǎn)生沉淀。

以苯酚作為*碳源時(shí)，苯酚的加入量為200～800 mg/L。

苯酚要在培養(yǎng)基滅菌后加入

制備固體分離培養(yǎng)基時(shí)需加入1.5g agar/100ml培養(yǎng)基。

F．R2A培養(yǎng)基

酵母提取物                 0.50 g /l

胰蛋白胨                   0.25 g /l

大豆胨 （Soytone）         0.25 g/l,

酸水解酪素                 0.50 g /l

葡萄糖                     0.50 g/l

可溶淀粉                   0.50 g /l

丙酮酸鈉                   0.30 g/l

K2H PO4                       0.30 g/l

 MgSO4·7H2O               0.05 g/l

瓊脂                       15.00 g /l

在加入瓊脂前用結(jié)晶的磷酸氫鉀或磷酸二氫鉀調(diào)整zui終PH值為7.2。加入瓊脂后，加熱培養(yǎng)基使其沸騰，瓊脂溶解后在121℃高壓滅菌15分鐘。

 LB液體培養(yǎng)基配方

       蛋白胨    10g

       酵母粉     5g

       NaCl       10g

       H2O          1000ml

       pH7.2